一名叫做Desmond Miles的酒吧服务生，某天被一家叫做Abstergo的国际制药集团绑架，对方的研究员告诉Miles，其实他是古代刺客宗师的直系后裔，需要分析他的DNA来提取祖先的记忆，因为他的祖先Altair知道伊甸园碎片的下落，通过这种方法，Abstergo可以找到这个神器的线索。尽管Miles对自己被绑架一事非常愤怒，但还是被研究员们强迫推入了虚拟机Animus之中，返回了12世纪的中东。
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12世纪的圣殿骑士和刺客联盟的争斗一直延续着，Miles作为刺客宗师的后裔，找到了祖先Altair的记忆。
Altair隶属于刺客组织阿萨辛，他的师父Mualim一直在寻找伊甸园碎片，这种神器的力量是给人幻觉，从而控制人的思想。Altair奉师父之名陆续杀死了九名圣殿骑士，为的是阻止第三次十字军东征，维护和平。当Altair顺利杀死九名目标后，渐渐察觉到自己已被欺骗：原来，当年有十个人找到了一块伊甸园碎片，这十人正是九名被杀的骑士和自己的师父Mualim，他之所以利用Altair刺杀掉九名骑士，只是为了一人独吞伊甸园碎片，然后通过这个神器控制人们的思想，实现自己独裁的梦想。得知这一切真相的Altair非常震惊，他火速返回刺客总部质问自己的师父，而目的达成的师父早已不管Altair的生死，于是师徒二人展开战斗，最终Altair成功杀死Mualim，得到了部分伊甸园碎片并将其埋藏，成为刺客联盟新的首领。
返回到现代的Miles，同样也得知Abstergo公司的计划：他们想通过Miles的DNA了解到伊甸园碎片的下落，找到并利用神器控制人类的思想，其目的与当年的Mualim基本相同。Abstergo目前已经持有部分伊甸园碎片，绑架Miles来此只是为了通过他找到当年被Altair埋葬的碎片。
这个时候Abstergo的研究员Lucy也向Miles表明身份，原来她是潜伏在Abstergo公司中的间谍，她的真实身份同样是刺客联盟的成员，为的只是帮助Miles逃离这里。
Animus的实验结束后，Miles非常奇异的获得了祖先的神奇能力“鹰之眼”，通过这个能力他发现了在实验室休息间的秘密。原来，在他来这里之前，已经有16位刺客后裔曾被陆续绑架来此，在实验结束后惨遭杀害，休息间墙壁上写满了他们的遗言。
一切结束后，Miles在Lucy的帮助下试图逃离实验室。